PCR分子诊断

  •  PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。
  •  在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
  •  20 世纪末,Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至少包含一个拷贝的目标分子(DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
  • 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

PCR分子诊断服务项目

数字PCR在肿瘤检测中的临床意义

数字 PCR 具有高敏感度、绝对定量、高特异性、使用标本用量少等特点,而且较好的克服了肿瘤组织包埋标本 DNA 质量差、标本量有限和血液标本ctDNA 丰度低等问题,是恶性肿瘤诊断和监测的可靠定量工具。

1. 肺癌的EGFR突变检测

EGFR 突变目前已成为非小细胞肺癌(Non-Small-Cell Lung Cancer,NSCLC)患者常规的伴随诊断,对于EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的使用具有重要的指导作用。然而,由于多数 NSCLC 都处于晚期,很难取到足够的肿瘤组织完成该检测。同时,液体活检中含有肿瘤来源的 DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)含量非常低,因此对检测方法提出了很高的要求。数字 PCR的检测敏感性可以低至 0.04%,可以显著提高血浆中EGFR 突变的检出率。此外,利用数字 PCR 绝对定量的优势,可以对血浆中 EGFR 突变的丰度进行动态监测,这种动态变化与患者使用 TKI 的疗效密切相关,可以更好的指导患者的治疗。

2. 肺癌的ALK融合基因检测

ALK 融合基因是 NSCLC 患者另外一个常规的伴随诊断,可以指导 ALK-TKI 药物的使用,目前已发现 20 种以上 EML4-ALK 的融合形式,多个报道证实它们中大部分能促进肿瘤生成。另外 ALK 还可能与 TFG、 KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN 等基因发生融合,因此ALK 融合突变的诊断具有一定难度。采用数字 PCR,利用 ALK 基因 3’端的过表达来鉴定 ALK 的融合,该方法既具有 PCR 方法特异性好、结果客观的优势,同时又不受融合类型的限制,可以检测所有融合型,在与三种传统方法的对比过程中展现出了更好的临床符合率,未来有望成为一种新

3. 乳腺癌的分型

ER,PR 和 HER2 是乳腺癌最常用的分子标志物,在患者在开始治疗之前必须要明确这几个分子标志物的具体状态。传统的检测方法是通过 IHC 来确定蛋白的表达情况,而 HER2 检测也还可以通过 FISH 来判断染色体的扩增情况。尽管相应的检测都有明确的指南来加以规范,但是在临床实践过程中,检测结果存在主观偏差。采用四重数字 PCR 方法,对这几个标志物同时进行定量检测。95 例石蜡标本的对比分析结果显示, HER2,ER 和 PR与 IHC 的一致性分别为 96.8%, 91.5% 和 85.1%,而 ROC 曲线下面积则分别为 0.991, 0.977 和 0.920,说明该方法与 IHC 方法有较好的一致性。此外,相比于 IHC 方法,数字 PCR 方法还具有操作和判读标准化、结果重复性好、检测周期短、标本使用量少等优势,未来在临床将会有很好的应用前景。

4. 甲基化析

异常的 DNA 甲基化涉及整个基因组的整体低甲基化和位于基因启动子区域和基因间 DNA 的 CpG 岛的局部超甲基化,这是人类恶性肿瘤中一个常见的表观遗传改变。然而,传统的 PCR 检测容易受到 PCR 抑制剂的影响,在非甲基化等位基因的背景下进行稀有甲基化等位基因检测的敏感性有限。而数字 PCR 是在无数个独立的分隔之中进行反应,因此彼此之间较少受到抑制剂的影响,能够对传统方法检测不到的罕见甲基化等位基因进行精准的检测,未来有望将 DNA 甲基化作为一个具有区域性癌变的预测指标或者癌症风险生物标志物来使用。

5. 单细胞的基因表达分析

基因表达分析有助于了解细胞和组织的特征及其如何应对发育和环境信号的改变。但是,在组成复杂的细胞混合物中,尽管显著表达的基因可以被识别出来,但来自于少数细胞群体的转录本却很可能会被掩盖掉,尤其是在每个细胞中以低丰度形式出现的转录本。为了解决这个问题,单细胞检测技术应用而生,而且逐渐受到了越来越多的重视。数字 PCR 在单细胞分析中的优势在于它不需要标准曲线就能进行绝对定量,无需进行其他方法所要求的单细胞 cDNA 预扩增,这可以消除预扩增和 NGS 文库准备中潜在的转录本定量失真,能够能加真实的反映单细胞群体中关键基因的特征。

6. 外周血MicroRNA的绝对定量

人体体液中稳定可检测的 miRNA 的发现为其作为疾病生物标志物提供了新的可能性,但是它们的含量可能极低,在体液中也缺乏已知的内源性参考基因,这为每一项可靠的转化应用都提出了真正的挑战。利用数字 PCR 的绝对定量优势,可以解决缺乏内源性参考基因的问题。同时,具有有很好的重复性,能够在低至 1 拷贝 /μl 的水平上检测到一个拷贝的 miRNA,这种性能完全超过了传统定量 PCR 的表现,这使得ddPCR 成为 microRNA 研究中非常有潜力的一个技术。

7. 微小残留病变(minimal residual disease,MRD)

微小残留病(MRD)导致的复发是目前血液肿瘤治疗的一大难题。动态监测 MRD 对于评价治疗疗效、预测疾病复发、实施个体化治疗具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。 数字 PCR 技术,其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰,浓缩低丰度目的基因信号,从而提高 MRD 检测的灵敏度。数字 PCR 作为目前灵敏度和准确性最高的分子检测方法,非常适用于微小残留病变评估。